A-TAILLE ET POIDS MOLÉCULAIRE:
1)Taille
A cause de leurs dimensions, les protéines ne diffusent pas à travers les membranes dont les pores sont inférieurs à quelques mm, tels que le collodion, le parchemin, le cellophane, tandis que des molécules plus petites et surtout les ions peuvent passer. On utilise ce phénomène de "dialyse" pour séparer les sels qui accompagnent les protéines. Les protéines ne dialysent pas.
2)Poids moléculaire:
Plusieurs méthodes permettent de déterminer le poids moléculaire des protéines.
a) Ultracentrifugation:
C'est à Svedberg que l'on doit cette méthode de centrifugation à grande vitesse, réalisée dans des appareils pouvant tourner à 60.000 tours/minute.
Les molécules protéiques en solution soumises à cette ultracentrifugation, sédimentent en fonction de leur densité. Les variations de concentration résultante de la sédimentation, sont suivies par des mesures de l'indice de réfraction. On obtient alors, la constante de sédimentation spécifique d'une protéine donnée, qui permet de faire le calcul de la lasse moléculaire.
L'ultracentrifugation en gradient de saccharose offre de meilleures conditions d'analyse.
b) Filtration par tamisage moléculaire.
Les gels de dextran utilisés(type séphadex)
sont des polyosides comportant un nombre variable de liaisons croisées lesquelles déterminent un degré de porosité. La pénétration des macromolécules dans ces gels est plus ou moins facile selon leur taille d'ou le nom de "Tamis moléculaire" que l'on donne parfois à ces colonnes de gel: Les plus grosses molécules, exclus du gel, sortiront les premières de la colonne ,tandis que les plus petites, pouvant y pénétrer seront retardées et sortiront en dernier . On a pu "calibrer" ces colonnes de gel de dextran en y faisant passer une protéine de masse moléculaire inconnue et déterminer ensuite cette dernière en fonction du moment ou la protéine sort de la colonne. (Des colonnes de gel d'acrylamide(biogel) peuvent être utilisées dans le même but.)
C:diffusion de lumière:
Quand une solution de protéine est traversée par un faisceau lumineux il y a diffusion latérale d'une partie de la lumière (effet tyndall ) la proportion de lumière diffusée augmente cependant que diminue évidemment la proportion de lumière transmise) lorsque le nombre et la taille des molécules en solution augmentent. la masse moléculaire d'une protéine peut donc être calculée a partir du rapport lumière incidente transmise.
B) SOLUBILITÉ
la plupart des protéines cellulaires sont solubles dans l'eau . la solubilité varie d'une protéine à l'autre en fonction du nombre de groupements hydrophiles existant à leur surface.
certaines protéines sont solubles dans l'eau pure, d'autres ne se dissolvent qu'en présence de sels neutres ou encore lorsque le milieu est légèrement acide ou faiblement alcalin, d'autres enfin (scléroprotéines) sont insolubles même dans ces diverses conditions. Un certain nombre de facteurs peuvent influencer la stabilité..
-influence des électrolytes
Les sels neutres interviennent en fonction de leur concentration et de la charges des ions c.à.d de la force ionique. A faible force ionique, on observe un effet dissolvant, tandis qu'a force ionique élevée au contraire, on assiste au rélargage, c.à.d a la précipitation des molécules protéiques. Toutes les protéines ne sont pas également sensibles a cet effet de relargage par addition d'un sel neutre; ainsi certaines protéines précipitent dans une solution a demi-saturée en sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 d'autres seulement lorsque la solution est a 60 ou75% saturée etc....
On peut donc par addition progressive d'un sel neutre (et en centre-figeant après chaque addition) fractionner un mélange de protéines, sinon totalement du moins partiellement.
-Influence du pH
Dans beaucoup de méthodes de fractionnement de protéines met a profit le fait qu’a force ionique et à température constantes la solubilité d’une protéine est minimale au voisinage du ph isoélectrique .dans certaines cas on peut obtenir la cristallisation d’une protéine en augmentant la concentration saline dans une solution maintenue a un ph principe de précipitation sélective
Plusieurs techniques basées sur ce principe de précipitation sélective paramètres permettent l’isolement de certaines protéines a partir d’un mélange protéique complexe en faisant varier différents paramètres (force ionique pH température solvants organiques)
B)Propriétés spectrales
La plupart des protéines présente une bande d’absorption assez large dans l’ultra-violet. Leur absorbance à 280 nm est surtout fonction de la teneur de chaque protéine en tyrosine et en tryptophane .Elle varie avec le pH et la meilleure sensibilité est obtenue à pH 10.Cette méthode de dosage est extrêmement sensible (0,1g/l) mais inutilisable que pour des solutions parfaitement limpides.
D) caractère amphotère
La plupart des groupements aminés et carboxyliques des acides aminés sont dans les protéines engagées dans des liaisons peptidiques.
Par contre les chaines latérales comportent des groupements ionisables qui confèrent aux protéines un caractère amphotère. Selon le pH de la solution, ces groupements sont plus ou moins ionisés en fonction de leur pK , de sorte que la protéine peut exister, lorsqu’on élève le pH sous les t rois états suivants : .
H+ H+
Protéine cation(+)çè(-)protéineZwitterion(+)çè(-)protéine Anion
Lorsque le nombre du groupement chargés positivement est égal au nombre de ceux chargés négativement, on est au pH isoélectrique.
Sauf au pH isoélectrique, les protéines migrent lorsqu’on les place dans un champ électrique. Si le pH est supérieur au point isoélectrique, la protéine est chargée négativement et migre vers l’anode, mais si le pH est inférieur au point isoélectrique, la protéine est chargée positivement et migre vers la cathode. La vitesse de migration des protéines vers l’anode ou vers la cathode dépendra de la quantité de charge nette(négative ou positive),de la forme, de la taille de la molécule ainsi que de la viscosité du milieu.
On peut donc fractionner les protéines par électrophorèse sur des supports tel que le papier acétate de cellulose le gel du polyamide.
Les supports gélifiés permettent un meilleur fractionnement des protéines car n plus de la charge nette de la protéine Intervient sa taille .Dans tous les cas l’emplacement des différentes zones ou sont localisées les protéines ayant migré différemment est repéré par une coloration spécifique des protéines (amido-schwartz rouge ponceau) cette méthode permet une analyse quantitative des différentes protéines d’un mélange car on peut doser par photodensitométrie la coloration des différentes zones.
-ANTIGENICITE
Les protéines de part leur taille et leur conformation présentent a leur surface des déterminants antigéniques capables de susciter la formation d’anticorps spécifiques lorsqu’elles sont injectées a un animal. Ces anticorps mis en présence de la protéine inductrice réagissent spécifiquement avec elle en formant un immun complexe insoluble facilement détectable.
Cette propriété est mise a profit pour la mise en évidence et le dosage d’une protéine donnée.
L’immun précipitation peut être réalisée soit en milieu liquide (opacimétrie turbidimétrie néphélémétrie etc. )Soit en milieu gélifié (immuno-diffusion radiale électroimmuno-diffusion immunoélectrophorèse etc.…)