La ttomographie cryo-électronique (cryo-ET) donne aux scientifiques la puissance pour atteindre l'échelle nanométrique, l'imagerie 3D des environnements cellulaires non perturbés. Cryo-ET a été utilisé avec succès pour résoudre des détails de structure précédemment cachés de complexes protéiques multiples et leur répartition au sein des cellules. En outre l'optimisation et la combinaison de cryo-ET avec d'autres techniques d'analyse promet un aperçu sans précédent dans les interactions entre protéines complexes qui animent l'activité cellulaire.
Les progrès récents dans la préparation et l'analyse des échantillons ont transformé la microscopie électronique (EM) en un outil puissant pour caractériser l'organisation moléculaire à l'intérieur des cellules. Couplage du nouveau procédé de tomographie cryo-électronique (cryo-ET) avec d’autres techniques existantes pour l’imagerie biologique et analyse biochimique pourrait révolutionner la façon dont les scientifiques à comprendre les rouages complexes du protéome.
OBSERVATION PRUDENTE
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Figue. 1 | Cryo-ET de polyribosomes A
tomogramme d'un polyribosome (image de
gauche), dans laquelle l' interprétation est
basée sur la tendance
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Chaque cellule contient en elle un large éventail de très modulaires multi-composants «machines» composées principalement de protéines, l'action concertée de qui entraîne des processus cellulaires essentiels tels que l'expression des gènes, la division cellulaire et l'activité métabolique. Certains de ces complexes sont suffisamment stables pour purifier et caractériser avec des détails au niveau atomique via des techniques telles que la cristallographie aux rayons X, mais beaucoup d’autres sont basées sur de courtes et de faibles interactions.
Bien que les techniques expérimentales existent qui aident les scientifiques déduisent la composition et la fonction de ces complexes, une solution préférée serait d'appliquer des techniques d'imagerie à haute résolution pour les visualiser dans leur contexte cellulaire sans perturber l'environnement physiologique . Une telle approche serait à la base des «protéomique visuelles», dans lequel les différentes protéines dans une cellule ou d'un autre échantillon biologique peuvent être directement observés dans leur habitat naturel plutôt que dans une préparation expérimentale fortement manipulée.
L'imagerie biologique connaît une renaissance. Les soi-disant lumière microscopie (LM) techniques super-résolution permettent maintenant aux enquêteurs d'observer des processus dynamiques dans les cellules vivantes à des résolutions inférieures à 50 nm. Cependant, ces techniques sont actuellement incapables de fournir vrai détail à l'échelle moléculaire et ne peuvent mettre en évidence les caractéristiques structurelles portant un marqueur fluorescent, alors que le contexte reste incertain. EM a continué à évoluer comme une technique puissante et complémentaire, offrant des niveaux inégalés de détail dans des «instantanés» congelés de cellules.
Des échantillons de microscopie électronique ont été préparés de façon traditionnelle avec des agents de fixation et de coloration chimique toxique et de l'eau a dû être retirée avant de transférer les échantillons dans le vide du microscope électronique. Ces traitements ont tendance à perturber l'agencement des composants cellulaires et produire des artefacts visuels trompeurs.
FIGÉ DANS LE TEMPS
ET est une variante de l'EM dans lequel les échantillons sont mis en rotation et imagées sous divers angles, ce qui donne de multiples images de projection qui peut être reconstruite en images tridimensionnelles de cellules, des organelles et d'autres structures. Au lieu d'enlever toute l'eau liquide, les échantillons sont rapidement congelés tels qu'ils deviennent intégrés dans la glace 'vitreuse. Dans ce milieu, comme le verre, les molécules d'eau sont disposées de façon aléatoire plutôt que sous forme cristalline, qui peut endommager les échantillons biologiques.
La technique résultant de cryo-ET évite ainsi les artefacts associés à EM classique, et fournit des reconstitutions très détaillées et spatialement précises de l'environnement cellulaire intact à résolution nanométrique. Cependant, l'absence d'agents de coloration signifie que les scientifiques doivent composer avec un contraste réduit, ce qui rend plus difficile de distinguer les structures d'intérêt dans le contexte de l'environnement cellulaire. Ceci est aggravé par le fait que les échantillons de glace embarqués sont vulnérables aux dommages causés par une exposition prolongée au faisceau d'électrons, ce qui signifie que les chercheurs doivent réduire au minimum l'exposition, ce qui se traduit par un faible rapport signal à bruit.
Afin de maximiser la qualité de l'information qui peut être obtenu à partir de ces tomographies sans compromettre l'intégrité de l'échantillon, les scientifiques ont associé des stratégies intelligentes pour la préparation des échantillons avec des algorithmes informatiques sophistiqués pour le traitement et l'analyse des données. Cela a permis aux scientifiques d'employer sucessfully cryo-ET pour visualiser un certain nombre de systèmes cellulaires complexes, dont les suivants: le complexe nucléaire à pores, qui est le «gardien» au noyau; les terminaux présynaptiques, à partir de laquelle les neurones émettent des signaux activateurs et inhibiteurs de leurs voisins; et les cordes de polyribosomes, qui sont les lignes d'assemblage qui gèrent la production de protéines à partir de l’ARN (fig.1). Pour les petites cellules, telles que les bactéries, il devient même possible de caractériser la répartition des populations de grands complexes multi-protéiques dans le volume cellulaire complet, et les premiers efforts visant à réaliser la protéomique visuels organisme à l' échelle ont été décrits pour les agents pathogènes humains Leptospira interrogans etmycobactérie pneumoniae .
VISUALISER LE FUTUR
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Cryo-ET d'un presynapse. Highlighted
est le réseau de connecteurs (rouge)
et longes (bleu
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Cryo-ET est encore une technologie émergente et ne sont pas encore largement utilisé, mais un proche avenir devrait voir des améliorations considérables qui vont grandement accroître la puissance de cet outil. Par exemple, bien que la zone qui peut être visualisée à l'aide efficacement cryo-ET est adapté à l'examen de nombreuses bactéries dans leur intégralité, elle reste trop faible pour couvrir une cellule humaine ou murine. Cette limitation de taille peut être surmontée par des approches dites «corrélatifs LM- EM ', dans lequel LM est utilisé pour examiner des échantillons à basse résolution afin d'identifier les sites d'intérêt pour l'analyse à haute résolution via cryo-ET. L’amélioration des méthodes de dissection seront également nécessaires pour veiller à ce que les chercheurs peuvent obtenir un accès facile à cibler les zones dans un grand paysage cellulaire - par exemple, en utilisant un faisceau d'ions focalisé sur 'rasage' un échantillon congelé précisément jusqu'à une profondeur appropriée pour l'imagerie.
Les méthodes de micro-usinage plus précises pourraient aussi mener à des approches plus globales de haut en bas pour comprendre la machinerie cellulaire. Par exemple, un territoire cellulaire pourrait être caractérisé au niveau structurel via cryo-ET, puis soigneusement excisée pour l'analyse par spectrométrie de masse ou techniques connexes qui permettent aux scientifiques de reconstituer des inventaires complets des protéines individuelles dans un volume d'échantillon donné. Cela pourrait, à son tour, contribuer à la génération d'atlas moléculaires contenant des détails précieux sur la façon dont les différents types de cellules répondent aux signaux externes, des dommages ou d'autres déclencheurs environnementaux.
Bien sûr, ces données auront également besoin d'outils logiciels plus sophistiqués; l'analyse des données reste fastidieuse et prend du temps, et dépend encore fortement sur la surveillance humaine. Idéalement, les algorithmes futurs seront capables d'interprétation automatique d'image avec la capacité de distinguer des objets ou des motifs individuels dans des environnements complexes.
Compte tenu des progrès réalisés à ce jour, il semble raisonnable de penser que, dans un avenir proche, cryo-ET permettra d'atteindre les niveaux de résolution et de sophistication qui permettent aux scientifiques de reconstituer avec précision les comportements complexes et la dynamique d'un large éventail de systèmes moléculaires multi-composants - ainsi que l'interaction entre eux - et ainsi avoir un aperçu sans précédent dans la «sociologie moléculaire» de la cellule.
Les humains sont une espèce très visuelle et, dans le sillage de nouvelles techniques d'imagerie, les sciences de la vie sont maintenant dans une autre phase visuelle. Tomographie cryo-électronique comble une lacune critique entre les techniques avec une résolution atomique et la microscopie optique, de combler le fossé entre les molécules et les études structurales cellulaires. Il donne un aperçu sans précédent dans la réalité moléculaire des cellules