Bloquer les effets négatifs de la sénescence dans les fibroblastes de peau humaine avec un extrait de plante
Il y a de plus en plus de preuves que les cellules sénescentes sont une force motrice derrière de nombreuses pathologies liées à l'âge et que leur élimination sélective augmente la durée de vie et la santé des souris. Les cellules sénescentes affectent négativement leur tissu environnant en perdant leur fonctionnalité cellulaire spécifique et en sécrétant un mélange pro-tumorigène et pro-inflammatoire d'hormones de croissance, de chimiokines, de cytokines et de protéases, appelé phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP). Ici, nous avons identifié un extrait de la plante Solidago virgaurea subsp. alpestris, qui présentait une faible activité sénolytique, a retardé l’acquisition d’un phénotype sénescent et induit un phénotype papillaire avec une fonctionnalité améliorée dans les fibroblastes dermiques humains. Lorsqu'il est administré à des fibroblastes sénescents prématurés induits par le stress, cet extrait modifie leur profil d'expression de l'ARNm global et réduit particulièrement l'expression de divers composants SASP, améliorant ainsi l'influence négative sur les cellules voisines. Ainsi, l'extrait végétal étudié représente une possibilité prometteuse de bloquer la perte de fonctionnalité tissulaire liée à l'âge.
Introduction
La sénescence cellulaire est impliquée dans le développement de maladies liées à l'âge et la perte de la fonctionnalité des tissus avec l'âge. Les cellules sénescentes s'accumulent in vivo et leur élimination sélective augmente la santé de la souris. Tandis que les cellules sénescentes transitoires ont des fonctions bénéfiques dans la cicatrisation, leur persistance chronique et leur accumulation avec l'âge affectent négativement le tissu environnant par le phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP). Il s'agit de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, de protéases de remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) et de facteurs de croissance, qui se traduisent par un cercle vicieux de perte fonctionnelle progressive des tissus et des organes. Les cellules sénescentes sont arrêtées de façon irréversible par l'intermédiaire du p53-p21 CIP1 ou de l’axe p16 INK4a -Rb, accumulent l'activité β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal) et présentent une morphologie typique.
L'un des premiers organes où les cellules sénescentes ont été identifiées in vivo, est la peau qui contient entre 20% et 60% de fibroblastes sénescents. Le derme de la peau humaine peut être divisé en deux couches distinctes, le derme papillaire supérieur et le derme réticulaire inférieur. Les fibroblastes isolés du derme papillaire ont une morphologie en fuseau maigre, une capacité de prolifération plus élevée et une sensibilité plus faible à l'inhibition de contact que leurs homologues réticulaires plats et irréguliers. Ils diffèrent également dans la production d'ECM et les facteurs de croissance, leur réponse aux facteurs de croissance et la signalisation épidermique et seuls les fibroblastes papillaires semblent être en mesure de soutenir la formation d'un équivalent de peau humaine entièrement différencié (HSE). Lorsqu'ils sont vieillis in vitro ou in vivo, les changements dans les caractéristiques cellulaires sont presque exclusivement observés dans les fibroblastes papillaires, ce qui conduit à l'hypothèse que l'atrophie liée à l'âge dans le derme papillaire de la peau humaine pourrait impliquer une processus de différenciation du phénotype papillaire au phénotype réticulaire. Nous suggérons de nommer ce processus "transition papillaire à réticulaire" (PRT).
Les effets négatifs de la sénescence cellulaire peuvent être contrecarrés par: (i) retarder la perte de la fonctionnalité spécifique du type cellulaire induite par la dé-ou trans-différenciation associée à la sénescence (comme par exemple par PRT), (ii) interférer avec les effets négatifs de SASP ou par (iii) l'élimination sélective des cellules sénescentes.
En effet, plusieurs médicaments cliniquement approuvés, y compris les glucocorticoïdes, la metformine, la rapamycine et les inhibiteurs de JAK, atténuent la SASP. En outre, des substances sénolytiques ont été identifiées comprenant la quercétine, le dasatinib, le navitoclax, la piperlongumine, la fisétine, les peptides inhibiteurs de A1331852, A1155463 et FOXO4.
Solidago virgaurea , également connu sous le nom de verge d'or, est traditionnellement utilisé comme phytothérapie anti-inflammatoire. Les composés isolés de S. virgaurea ont une activité cytotoxique, antimicrobienne, anti-mutagène, antifongique, analgésique, anti-inflammatoire, anti-oxydante et diurétique. Une étude récente a identifié l'acide 3,4,5-tri- O- caffeoylquinique comme le constituant ayant la plus forte réduction des concentrations de facteur de nécrose tumorale alpha et d'interleucine (IL) -1β dans un modèle d'œdème de la patte de rat induit par la carragénine. Cependant, l'effet des extraits de S. virgaurea sur la sénescence cellulaire et les sous-populations de fibroblastes n'ont pas été étudiés jusqu'à présent.
Ici, nous rapportons un extrait alcoolique de Solidago alpestris (1201) avec la capacité de bloquer les effets négatifs de la sénescence dans les fibroblastes de la peau humaine, y compris le SASP et PRT in vitro.
Résultats et discussion
Un traitement à long terme avec 1201 retarde légèrement la sénescence réplicative et la PRT des fibroblastes dermiques humains
Afin d'identifier les extraits de plantes ayant des activités qui influencent la PRT, nous avons criblé sept extraits de plantes différents, dont l'un a dû être exclu de toute analyse ultérieure en raison d'un effet cytotoxique. En tant que critères de sélection pour les extraits de plantes, nous avons mis l'accent sur la capacité à induire des caractéristiques cellulaires de fibroblastes dermiques humains (HDF) papillaires et à réduire l'activité de la SA-β-galactosidase. 1201 a montré les effets les plus nets en termes de modification de la morphologie cellulaire et de réduction de l'activité SA-β-galactosidase et a donc été sélectionné pour des études ultérieures. Pour étudier les conséquences d'une exposition à long terme à 1201, nous avons cultivé des HDF à partir de doublement de population 32 en présence de 1201. Les cellules 1201 ont conservé une morphologie papillaire et une densité cellulaire comparables à celles des cellules jeunes réplicatives 160 jours en culture, comparé à 95 jours pour les témoins. Alors que le traitement avec 1201 n'a pas eu un effet substantiel sur le taux de croissance ou la durée de vie réplicative, il a conservé la morphologie cellulaire des cellules de passage précoce.
Pour tester l'hypothèse selon laquelle la PRT et le processus de vieillissement cellulaire sont effectivement liés, nous avons comparé l'expression de marqueurs d'ARNm pour les fibroblastes papillaires et réticulaires avec un marqueur de sénescence cellulaire, p21 (CDKN1A). 1201 a empêché l'augmentation de p21 et des marqueurs réticulaires, la sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 1 14A (PPP1R14A) et l'alpha-2-macroglobuline (A2M), à la fin de la durée de vie réplicative. Bien que les marqueurs papillaires, la podoplanine (PDPN) et la nétrine-1 (NTN1), n'aient pas montré de tendance nette au cours de la durée de vie réplicative, leurs niveaux d'expression restaient généralement inférieurs aux niveaux des cellules à passage précoce. Conformément à la morphologie observée et à l'expression des marqueurs réticulaires, l'expression des marqueurs papillaires a été augmentée par traitement avec 1201, pour la majorité des points temporels Seulement dans les cellules de passage précoces qui n'ont pas encore acquis de morphologie réticulaire ou au dernier moment, où toutes les cellules présentent une morphologie réticulaire, 1201 n'a montré aucun effet sur la PRT. Ainsi, nous concluons que (i) en accord avec les résultats d'une étude précédente, PRT accompagne la sénescence réplicative menant à un statut plus réticulaire des fibroblastes sénescents et (ii) que PRT est reportée par 1201 traitement.
1201 renverse PRT
Afin de confirmer que 1201 rétablit le PRT ou au moins maintient le phénotype papillaire, les HDF à un PD intermédiaire ont été cultivées en présence de 1201 pendant 48 h et ont acquis une morphologie de type papillaire Après cinq PD, cette morphologie de type cellule jeune de forme papillaire a été maintenue en combinaison avec des densités cellulaires plus élevées et / ou une prolifération accrue . A l'appui de ceci, les niveaux de marqueurs papillaires PDPN et NTN1 ont été augmentés, tandis que les marqueurs réticulaires PPP1R14A et A2M et le nombre de cellules SA-ß-gal positives ont été réduits avec un traitement 1201
Ensuite, nous avons testé l'effet de 1201 sur la formation de HSE pleine épaisseur, considérant que la diaphonie dermo-épidermique et l'influence sur le processus de différenciation épidermique est l'une des différences rapportées entre les HDF papillaires et réticulaires. En effet, lorsque 1201 a été complété au milieu lors du processus de différenciation de la couche épidermique, nous avons observé une augmentation de l'épaisseur épidermique par rapport aux témoins non traités . En outre, les HSE traités au 1201 présentaient une extension accrue de la couche granuleuse, visible par une coloration accrue de la filaggrine et de la loricrine et une augmentation de l'épaisseur de la couche suprabasale colorée avec la kératine 10. Un effet similaire de la différenciation épidermique a déjà été observé lorsque les HSE étaient construits en utilisant des HDF papillaires contre réticulaires de vieux donneurs ou des HDF papillaires précoces ou tardives ainsi que dans des cultures organotypiques formées avec des HDF papillaires ou réticulaires appariés au site. Une réduction de la filaggrine et la loricrine a également été observée au cours du vieillissement et in vivo dans des modèles HSE pour cutanée et le vieillissement de l’épiderme. Une cause de ce phénomène a été suggérée comme étant un effet paracrine du facteur de croissance des kératinocytes (FGF7) qui a été augmenté dans les HDF papillaires réticulaires ou in vivo. En effet, les HDF cultivés en présence de 1201 ont montré une réduction significative de l'expression de l'ARNm de FGF7. L'exposition des HDF à deux composants majeurs du 1201, l'acide chlorogénique et l'acide isochlorogénique A, n'a toutefois pas modifié la morphologie ou l'expression de PDPN, NTN1 et PPP1R14A, suggérant que d'autres composés présents dans 1201 seuls ou en combinaison sont responsables des effets observés
De plus, nous avons isolé les fibroblastes papillaires et réticulaires du derme comme décrit et confirmé l'expression du marqueur d'ARNm ;L'exposition des fibroblastes réticulaires à 1201 pour deux PD a entraîné des changements morphologiques visibles vers un phénotype de type papillaire Les cellules exposées à 1201 ont atteint des densités cellulaires plus élevées et les deux marqueurs papillaires ont été significativement induits alors que les marqueurs réticulaires ont été réduits Il n'y avait pas de changement significatif du nombre de cellules SA-ß-gal-positives détectables, qui pourrait être due à la faible activité SA-β-gal basale des cellules de passage précoce. Ces données soutiennent ensemble l'idée que PRT se produit avec le passage en série des HDF et est reportée par 1201.
1201 réduit les caractéristiques de la sénescence tout en ne soulageant pas l'arrêt du cycle cellulaire
Pour étudier l'effet de 1201 sur des cellules déjà sénescentes, les HDF ont été traitées avec 1201 après que le SIPS ait été induit avec un stress oxydatif chronique et comparé à des cellules quiescentes confluentes. Bien qu'aucun changement sur p21 n'ait été observé après 4 jours de traitement avec 1201 , le nombre de cellules SIPS de SA-ß-gal-positives était significativement réduit déjà après 4 et 11 jours de traitement , ce qui indique que 1201 a également fait effet qui étaient entièrement HDF sénescence avant le traitement sans atténuer l'arrêt de la croissance irréversible.
Afin d'analyser l'effet de 1201 sur le niveau du transcriptome, le séquençage de l'ARN (RNA-Seq) a été effectué après quatre jours de traitement 1201 dans des cellules SIPS et contrôle quiescent. De ce fait, le transcriptome de cellules SIPS traité par 1201 semble plus proche de celui de cellules quiescentes que de cellules SIPS Les données brutes sont accessibles au public sur le site Web de Gene Expression Omnibus (GEO) (numéro d'accession GSE93535).
La classification des annotations fonctionnelles des ARNm qui ont été significativement modifiées par SIPS et inversées par 1201 a révélé une forte corrélation avec les processus de la réponse immunitaire parmi d'autres Sur les 89 facteurs SASP publiés, 29 ont été régulés à la hausse dans les HDF SIPS dont 7 ont été significativement réprimés par 1201 .En outre, nous avons inclus CXCL1, en dépit d'être pas augmenté de manière significative par notre traitement SIPS ( p = 0,13), en raison de son rôle en tant que facteur SASP chimiotactique et pro-tumorigène important et sa réponse au traitement avec 1201. En recherchant les gènes régulés à la hausse dans les HDPS SIPS pour le mot clé "sécrété" (KW-0964), Les facteurs SASP ont été identifiés, dont 21 ont été régulés à la baisse par 1201 sur le niveau d'ARNm. Ainsi, au total, sur 222 facteurs SASP connus et putatifs détectés, 28 ont été au moins partiellement restaurés à des niveaux normaux d'ici 1201. Les ARNm sélectionnés ont ensuite été confirmés par des qPCR pour être exprimés de manière différentielle en utilisant la corrélation de Pearson, avec des valeurs de R allant de 0,88 à 0,99 .
Une analyse détaillée de la voie a révélé plusieurs voies proéminentes liées à la SASP, qui ont toutes été restaurées par traitement avec 1201. En outre, l’analyse Consensus PathDB a révélé que 1201 régule à la baisse les voies liées au système immunitaire dans les cellules sénescentes, y compris la voie JAK-STAT.
A la recherche de voies surexprimés par 1201 dans les deux, les cellules quiescentes et SIPS, nous avons identifié des voies liées à l'ECM et des protéines interagissant ECM , ce qui est en accord avec nos données montrant augmentation de l' épaisseur de l' épiderme en HSE . En outre, la signalisation Wnt / β-caténine, l'une des rares voies activées par 1201, a déjà été montrée comme affectant différentiellement les fibroblastes papillaires et réticulaires chez la souris, en ce qui concerne leur prolifération ainsi que leur dépôt d'ECM cicatrisation et formation de follicules pileux. .
Les régulateurs en amont prédits inhibés par 1201 étaient soit liés à des réponses inflammatoires, des facteurs de croissance ou des régulateurs transcriptionnels contrôlant les gènes impliqués dans la réponse au stress et le vieillissement. PTPN6, KDM5B et PTEN ont tous été activés par le traitement avec 1201 et sont des facteurs qui pourraient médier l'atténuation observée de la SASP en inhibant potentiellement la voie JAK / STAT, GATA4 et PI3K / AKT, respectivement. Fait intéressant, la curcumine et le resvératrol, deux composés polyphénoliques ayant des propriétés anti-tumorigènes et anti-inflammatoires ont également été identifiés comme régulateurs en amont prédits, indiquant que les composants polyphénoliques de 1201 pourraient avoir des modes d'action similaires à ces substances bien connues.
1201 atténue les effets médiés par SASP des cellules sénescentes
Afin de voir si 1201 est capable d'atténuer les changements de communication intercellulaire associés à l'âge, nous avons testé si elle diminue l'effet pro-prolifératif précédemment observé des fibroblastes sénescents sur la lignée cellulaire pré-néoplasique HaCaT. Par conséquent, SIPS ont été pré-HDF traités pendant 4 jours avec 1201 et par la suite les cellules HaCaT étaient soit co-cultivées avec SIPS ou cultivées avec HDF milieu conditionné pendant huit jours sans l'ajout de 1201. En effet, SIPS pré-traitée HDF avec 1201 a montré une stimulation de la croissance réduite des cellules HaCaT en co-culture ou avec un milieu conditionné uniquement
1201 a également aboli la chimio-attraction des surnageant de SIPS HDF vis-à-vis des cellules mononucléaires du sang périphérique humain.
Enfin, 1201 restauré l'impact négatif de SIPS HDF dans la formation HSE, en particulier sur la capacité des kératinocytes primaires pour former une couche de l' épiderme complètement différencié, comme il a sauvé la réduction dépendant de la cellule sénescente de l'épaisseur de l' épiderme et la différenciation altérée des kératinocytes, que nous avons rapporté plus tôt (Weinmüllner et al., en préparation).
1201 présente une activité sénile modérée
Afin d'évaluer si 1201 a également des propriétés sénolytiques, nous avons cultivé des SIPS et des HDF quiescents avec 1201 pendant 39 jours. Le traitement avec 1201 a entraîné une réduction significative du nombre de cellules des cellules sénescentes de 30%, tandis que les nombres de cellules quiescentes n'ont pas été significativement affectés. Le traitement de HDPS SIPS pendant seulement 4 jours avec 1201 n'a pas entraîné une réduction significative du nombre de cellules, donc l'atténuation de la SASP et son effet sur d'autres cellules n'a pas été causé par un effet sénolytique (Figures supplémentaires S9 et S10 ). Un traitement à court terme avec des doses élevées a indiqué que l'effet sénolytique de 1201 est basé sur l'induction de l'apoptose .
Conclusion
L'extrait végétal 1201 était non seulement capable de retarder l'acquisition d'un phénotype sénescent, mais conservait un phénotype papillaire et la fonctionnalité des HDF en ce qui concerne leur capacité à stimuler la formation d'une HSE pleine épaisseur. En outre, 1201 a inversé le profil d'expression génique des fibroblastes sénescents vers une cellule quiescente ressemblante et réduit l'expression de divers facteurs SASP. En conséquence, les effets négatifs de la SASP sur les cellules voisines ont été améliorés, à savoir la stimulation de croissance des cellules HaCaT pré-néoplasiques, l'attraction pro-inflammatoire des cellules immunitaires et l'altération des kératinocytes pour se différencier et former un épiderme entièrement stratifié. Dans le même temps, 1201 n'a pas annulé l'arrêt irréversible de la croissance suppressive de tumeur imposée par la sénescence.
L'identification d'un traitement qui atténue simultanément la sénescence cellulaire et induit un phénotype papillaire soutient l'hypothèse que la sénescence cellulaire des HDF est un processus de différenciation, dans lequel le phénotype réticulaire représente un stade de transition vers le phénotype sénescent. La sénescence cellulaire des HDF a déjà été proposée précédemment comme un processus de (dé) différenciation, mais ni la situation in vivo, ni les différentes sous-populations dermiques n'ont été considérées jusqu'à présent.
Toutes les substances, qui ont été précédemment signalées comme améliorant la SASP, ont exercé leur effet en ciblant la signalisation NF-KB, IL1A ou la voie JAK / STAT. L'analyse des voies de nos données RNA-Seq a démontré que 1201 est capable de cibler plusieurs voies impliquées dans l'inflammation, le vieillissement et la tumorigenèse. Les acides caféoylquiniques avec leurs propriétés anti-inflammatoires sont susceptibles d'être candidats pour la propriété atténuante SASP de 1201, alors que les trois dérivés de la quercétine, l'un des trois sénolytiques naturels rapportés jusqu'à présent, pourraient être la force motrice de la lenteur mais élimination sélective significative d'environ un tiers des cellules sénescentes. L'induction d'un phénotype papillaire pourrait être due à une interférence avec la signalisation du TGFβ qui s'est avérée être la force motrice de la PRT ou en raison de l'inhibition de la signalisation mTOR / PI3K / AKT, ce qui réduit la coloration de SA-β-gal et induit une morphologie de type papillaire. En outre, Wnt et signalisation ILK ont été identifiés comme cibles potentielles qui doivent être activés pour contrer les effets négatifs de sénescence. Cependant, la caractérisation complète de 1201 et l'identification des molécules responsables des effets identifiés feront l'objet d'études ultérieures.
Pris ensemble, nous avons identifié un extrait de plante qui est capable de bloquer les effets néfastes de la sénescence cellulaire dans les HDF et de maintenir leur fonctionnalité. De plus, nos résultats apportent des preuves supplémentaires d'un lien entre la sénescence cellulaire et la PRT. Nous avons également identifié de nombreux nouveaux facteurs SASP putatifs, soulignant que la liste des membres SASP acceptés pourrait ne pas être complète et doit être organisée dans un effort collectif, comme par exemple par les bases de données disponibles.
Matériaux et méthodes
Extrait de plante (1201) préparation et caractérisation
L'extrait éthanolique 1201 de S. virgaurea sous-espèce alpestris a été préparé à partir de parties de plantes aériennes séchées et solubilisé avec un mélange de 1,3-propanediol (Sigma-Aldrich, France) et d'eau désionisée.
Quatorze composants du 1201 ont été identifiés par chromatographie en phase liquide et en phase inverse haute performance suivie de spectrométrie de masse en tandem: acide chlorogénique, deux isomères de l'acide caféoylquinique, acide octulosonique B et C, isoquercétine, leiocarposide, rutine, quercétine arabinoside, astragaline, cynarine, 3 L'acide 4- et 3,5-di-caffeoylquinique et la nicotiflorine.
Isolement cellulaire
Tous les fibroblastes et les kératinocytes ont été isolés à partir de biopsies cutanées de donneurs adultes en bonne santé. Les cellules HaCaT ont été obtenues auprès du Centre allemand de recherche sur le cancer (Heidelberg, Allemagne). Les HDF ont été obtenus auprès d'Evercyte (Vienne, Autriche). Les kératinocytes et les HDF utilisés pour la construction du HSE ont été isolés à partir d'une biopsie cutanée achetée auprès de Biopredic International (Saint-Grégoire, France). Le comité d'éthique de l'université de médecine de Vienne (1149/2011) a approuvé la collecte de la biopsie utilisée pour l'isolement des kératinocytes pour les HSE contenant des HDPS SIPS. Les HDF papillaires et réticulaires appariés au site ont été isolés du derme comme décrit et leur identité a été confirmée par la mesure des niveaux d'expression de trois marqueurs d'ARNm papillaires et trois réticulaires. Les HDF papillaires et réticulaires appariés au site ont été isolés du tissu excédentaire de donneurs sains par le Department of Dermatology du Leiden University Medical Center (Leiden, Pays-Bas) conformément à l'article 467 de la loi néerlandaise sur le traitement médical et le Utilisation de tissus humains de la Fédération néerlandaise des sociétés scientifiques biomédicales. Le comité d'éthique de l'université médicale de Vienne (1326/2013) a approuvé l'isolement des PBMC à partir d'échantillons de sang donnés par des donneurs adultes en bonne santé. Toutes les souches cellulaires ont été testées pour des mycoplasmes à intervalles réguliers. L'isolement des cellules a été approuvé par la commission d'éthique locale respective et tous les donateurs ont donné leur consentement éclairé. Ainsi
Culture de cellules
Des kératinocytes humains primaires ont été cultivés dans du milieu kératinocytaire DermaLife K (LL-0007, CellSystems). Les fibroblastes et les cellules HaCaT ont été cultivées avec du DMEM / Ham's F-12 (mélange 1: 1) (F4815, Biochrome) additionné de 10% de sérum de veau foetal (F7524, Sigma) et de 4 mM de L- glutamine (G7513; , 7% CO 2 et 37 ° C. Les cellules ont été détachées par incubation avec 0,1% de trypsine et 0,02% d'EDTA à 37 ° C pendant 5 minutes et divisées à des rapports entre 1: 2 et 1: 6 en fonction du type cellulaire et du taux de croissance. Les cellules ont été comptées en utilisant un compteur de cellules automatisé Vi-CELL XR (Beckman Coulter).
Essai de prolifération
Les HDF ont été ensemencés dans des plaques de culture à six puits à raison de 40 000 cellules par puits. Au cours de l'expérience, les cellules n'ont pas été soumises au passage et les milieux ont été changés tous les 3 à 5 jours. Aux points temporels indiqués, les cellules ont été détachées par trypsinisation et comptées en utilisant un compteur cellulaire automatisé Vi-CELL XR (Beckman Coulter).
Isolement de l'ARN et RT-qPCR
Les cellules ont été lysées dans du réactif TRI (Sigma) et l'ARN a été isolé en suivant le protocole du fabricant. La concentration et la qualité de l'ARN ont été mesurées avec un spectromètre ND-1000 (NanoDrop). L'ADNc a été synthétisé à partir de 500 ng d'ARN total en utilisant un kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems) et quantifié avec le mélange qPCR HOT FIREPol® EvaGreen® 5x avec ROX (Solis BioDyne) en utilisant un cycleur Rotor-Gene Q (Qiagen) et les paires d'amorces respectives .Les valeurs d'expression ont été normalisées à l'ARNm de GAPDH.
Coloration SA-β-gal
La coloration au SA-ß-gal a été effectuée selon des procédures standard. Quinze images aléatoires ont été prises par puits à un grossissement x 100 et après randomisation, les cellules positives et négatives ont été comptées en aveugle.
HSE pleine épaisseur
En tout, 330 000 HDF par HSE ont été incorporés dans une matrice de collagène contenant du collagène de queue de rat de type I (Corning), 10 DMEM (Thermofisher) et du bicarbonate de sodium (Gibco / Invitrogen), insérés dans six inserts de culture (Thermofisher) et placé dans des plaques de culture profondes à six puits (Thermofisher). Après 2 h de polymérisation à 37 ° C, HSE ont été équilibrés dans du milieu DMEM additionné de 10% de sérum de fœtus bovin (Sigma) et placées à 37 ° C, 5% CO 2 . Après 3 jours, 150 000 kératinocytes ont été ensemencés sur le dessus et immergés pendant 7 jours dans du milieu DMEM additionné de 10% de sérum fœtal bovin et de facteurs de croissance (EGF, isoprotérénol, hydrocortisone). Puis les inserts ont été placés à l'interface air-liquide pendant 7 jours pendant lesquels le milieu a été complété avec 1201.
Les HSE ont été fixés dans du formol à 10% avant d'être plongés dans de la paraffine et découpés en sections de 5 μm d'épaisseur. La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine a été réalisée en utilisant un protocole standard. La coloration immunohistochimique a été réalisée en utilisant un protocole standard et les anticorps primaires suivants: fillagrin (Abcam, ab17808), loricrine (Abcam, ab24722), kératine 10 (Abcam, ab9026) et les anticorps secondaires suivants: α-souris Alexa 488 (Abcam, ab150113) et Alexa-lapin 546 (Life technologies, A11010).
SIPS
Les cellules ont été ensemencées à une densité cellulaire de 3.500 cellules / cm 2 un jour avant le traitement. Les cellules ont été traitées neuf fois avec 100 pM de H 2 O 2 additionné aux médias pendant 1 h, suivie par un changement de milieu. L'induction de la sénescence prématurée a été vérifiée par coloration au SA-ß-gal, expression de p21 et absence d'incorporation de BrdU. La coloration AnnexinV / PI a été réalisée pour s'assurer que le traitement était non létal et les HDPS SIPS ont été cultivées et surveillées pendant plus de 50 jours pour assurer que l'arrêt de croissance induit était permanent (Terlecki et al. En préparation).
Séquençage de nouvelle génération et analyse de données
La préparation de la banque et le séquençage ont été réalisés sur une plate-forme Illumina HighSeq 2000 (GATC Biotech AG, Constance, Allemagne). Toutes les étapes d'analyse ont été effectuées selon le Pipeline Suite Tuxedo. En bref, le logiciel Illumina Casava 1.8.2 a été utilisé pour les appels de base. Les lectures d'ARN-seq ont été alignées sur l'assemblage du génome hg19 en utilisant TOPHAT Version 2.0.13 avec les paramètres par défaut.
Les transcriptions ont été assemblées dans la version 2.1.1 de Cufflinks et les gènes différentiellement exprimés ont été prédits par Cuffdiff. La visualisation des données a été effectuée dans R en utilisant le paquet CummRbund et le logiciel Unscrambler X (Camo). L'analyse de classification fonctionnelle et le filtrage pour le mot clé "sécrété" (KW-0964) ont été réalisés en utilisant DAVID v6.8. L'analyse des voies a été réalisée avec le logiciel d'analyse de voie Ingenuity (Qiagen). L'analyse de l'enrichissement des voies a été réalisée en utilisant ConsensusPathDB, en utilisant l'outil d'analyse de surreprésentation. Nous avons recherché dans toutes les bases de données les chemins d'accès avec un chevauchement minimal et un seuil de valeur p de 0,0001.
Stimulation de la croissance des cellules HaCaT en co-culture avec SIPS HDF
Des cellules HaCaT ont été cultivées pendant 48 h dans un milieu minimal KGM (milieu KGM basal supplémenté uniquement avec de l'insuline et de l'hydrocortisone, Lonza). Ensuite, 20 000 cellules par puits ont été ensemencées dans des plaques de culture à six puits contenant des HDPS SIPS. Les cellules ont été co-cultivées dans du milieu minimal de KGM pendant 8 jours, puis colorées avec a-K14 (ab7800, Abcam) et DAPI (Fisher Scientific). Quinze images par condition ont été prises au grossissement x 50 en utilisant un microscope à fluorescence DMI6000 CS (Leica) et les cellules K14-positives ont été comptées. Les HDF SIPS 1201 ont été prétraités pendant 4 jours avec 1201 avant l'expérience. Au cours de la co-culture avec des cellules HaCaT, 1201 n'a pas été ajouté au milieu.
Stimulation de la croissance des cellules HaCaT avec du milieu conditionné de SIPS HDF
Vingt mille cellules HaCaT par puits ont été ensemencées dans des plaques de culture à six puits et cultivées pendant 48 h avec un milieu minimal KGM. Par la suite, les cellules ont été cultivées pendant 8 jours avec un milieu conditionné dérivé de HDPS SIPS. Les HDF SIPS 1201 ont été prétraités pendant 4 jours avec 1201 avant l'expérience. Pendant le conditionnement du milieu et la culture subséquente des cellules HaCaT, 1201 n'a pas été ajouté au milieu.
Test de chimiotaxie
Un essai de chimiotaxie avec une chimiotaxie μ-Slide (IBIDI) a été réalisé conformément au manuel du fabricant (Note d'application 17 et 23), en utilisant du milieu conditionné de HDPS SIPS et de PBMC fraîchement isolés du sang humain par centrifugation en gradient Ficoll. L'imagerie des cellules vivantes a été réalisée à l'aide d'un microscope DMI6000 CS (Leica) équipé d'une chambre de CO 2 chauffée (OKOLAB) et d'une platine automatisée. Pendant 12 h, une image / 2,5 min a été prise. Pour chaque condition, 30 cellules ont été suivies en utilisant le plugin de suivi manuel et analysées avec le plugin d'outil de chimiotaxie et de migration (IBIDI) dans ImageJ. Les HDF SIPS 1201 ont été prétraités pendant 4 jours avec 1201 avant l'expérience. Pendant le conditionnement du milieu et le test de chimiotaxie ultérieur, 1201 n'a pas été ajouté au milieu.
HSE pleine épaisseur contenant des HDF SIPS
Les HSE ont été construites comme récemment publiées utilisant 250 000 HDPS de SIPS et 1,5 million de kératinocytes humains primaires par équivalent de peau. Les HDF SIPS 1201 ont été prétraités pendant 4 jours avec 1201 avant l'expérience. Lors de la construction du HSE, le 1201 n’ont pas été ajoutés au milieu.
HSE ont été fixés avec Roti®-Histofix 4% (P087, Carl Roth), et inclus en paraffine pour une analyse histologique supplémentaire. La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine a été réalisée en utilisant un protocole standard.
Analyses statistiques
Les barres d'erreur sont présentées en tant que moyenne ± écart-type. Sauf mention contraire, la signification statistique a été évaluée en utilisant un test t de Student bilatéral et une hypothèse de variance égale. ANOVA a été réalisée avec SigmaPlot 12.5 et les données ont été testées pour la variance égale et la distribution normale (Shapiro-Wilk). Les niveaux de significativité ont été notés: * P <0,05, ** P <0,01 et *** P <0,001.
Disponibilité des données
Les données brutes de l'ARN-seq sont disponibles sur le Gene Expression Omnibus avec le code d'accession GSE93535 ; Toutes les autres données qui soutiennent les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.
Information additionnelle
Note de l'éditeur: Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.