Le profil du transcriptome tissulaire spécifique de Drosophila révèle les rôles des facteurs de transcription GATA dans la longévité par restriction alimentaire
La restriction alimentaire (DR) prolonge la durée de vie des animaux, mais impose des coûts de mise en forme. Ce phénomène dépend des acides aminés essentiels alimentaires (EAA) et de la signalisation TOR, qui exerce des effets systémiques. Cependant, les rôles des tissus spécifiques et des régulateurs transcriptionnels autonomes dans la cellule dans divers aspects du phénotype DR sont inconnus. Manipuler les facteurs de transcription pertinents (TFs) spécifiquement dans les tissus limitant la durée de vie peut séparer les avantages de la DR de la durée de vie des coûts de conditionnement physique au début de la vie. Ici, nous analysons systématiquement la transcription à travers les organes de Drosophila soumis à DR ou TOR faible et prédire TFs réglementaires. Nous pronostiquons et validons les rôles de la famille GATA de TFG conservée de manière évolutive, et identifions la conservation de ce signal chez la souris. Surtout, en limitant knockdown de la TF GATAsrp à des tissus spécifiques de mouche récapitulé les avantages, mais pas les coûts de DR. Ensemble, nos données indiquent que les TF GATA médient les effets des acides aminés alimentaires sur la durée de vie, et qu'en les manipulant dans des tissus spécifiques, il est possible de récolter les bénéfices de fitness des EAAs, découplés d'un coût à la longévité.
Introduction
Comment pouvons-nous contrer le vieillissement? Répondre à cette question est un objectif majeur, étant donné que la durée de vie de l'être humain dépasse de loin les progrès en gérontologie à un coût social, personnel et financier considérable. La restriction alimentaire (DR), une légère réduction de l'apport en nutriments sans malnutrition, a la capacité conservatrice évolutive d'améliorer la santé tout au long de la vie, mais au prix d'une réduction de la forme et de la vigueur biologiques chez les jeunes. Bien qu'ayant été découvert il y a plus de 80 ans, les mécanismes moléculaires sous - tendant la longévité DR demeurent insaisissables. L'élucidation de ces mécanismes pourrait aider à isoler les avantages de la RD des coûts corollaires.
Les bénéfices de la DR sur la durée de vie peuvent être récapitulés en ajustant l'abondance relative des nutriments, sans restreindre la quantité de nourriture consommée. Chez la drosophile, le rapport entre le sucre alimentaire et la levure module la durée de vie, qui est expliquée par les acides aminés essentiels (EAA) de la levure. Fait important, ce mécanisme est conservé chez la souris. Les EAAs régulent à la hausse la signalisation de la rapamycine (TOR) , et des preuves récentes indiquent que le phénotype de la drosophile restreinte à l'EAA est récapitulé par la suppression pharmacologique de TOR. Comprendre comment TOR limite la durée de vie est incomplète, bien que le maintien de la qualité du protéome joue probablement un rôle.TOR affecte également la transcription, mais à ce jour cette sortie a été relativement mal étudiée.
Chez la drosophile, les réponses transcriptomiques à la RD ont été caractérisées au niveau cellulaire et organismique. La caractérisation de la transcription spécifique à un tissu peut s'avérer essentielle pour comprendre la nature du compromis entre la durée de vie et la forme physique imposée par la RD. Les EAA sont des nutriments inhabituels car, par définition, ils ne peuvent être ni synthétisés ni stockés. Par conséquent, leur dilution dans le régime modifie probablement les niveaux d'EAA uniformément dans les tissus. Cependant, cette signalisation altérée peut limiter la durée de vie dans seulement un sous-ensemble des tissus affectés. Dans ce cas, la longévité peut être obtenue en reprogrammant spécifiquement un état de signalisation de type DR dans ces tissus, tout en épargnant d'autres tissus de cette manipulation, ce qui favoriserait leur fonction optimale. Une telle manipulation offrirait les avantages d'un régime alimentaire EAA, découplé de ses effets pernicieux de raccourcissement de la durée de vie. À ce jour, il existe des preuves de Drosophila que les avantages de la RD sont médiés au moins en partie par l'intestin mais pas l'ovaire, suggérant que les coûts et les avantages du changement alimentaire peuvent en effet être répartis entre les tissus. Nous nous sommes donc focalisés sur le détail systématique des modifications transcriptionnelles tissulaires spécifiques induites par DR. Nous évaluons également la mesure dans laquelle les changements transcriptionnels DR-dépendants peuvent être expliqués par la signalisation TOR, en supprimant son activité dans un contexte EAA-replet, et en mesurant le degré auquel l'état DR ressemble à l'état TOR faible. Nous prédisons ensuite quels facteurs de transcription (TFs) interviennent dans les changements transcriptionnels observés. Nous prévoyons et validons expérimentalement un rôle pour la famille GATA des TFs dans la longévité DR. Fait important, nous confirmons que les coûts et les avantages de la RD peuvent être répartis entre les tissus par manipulation TF ciblée.
Résultats
Cette étude a nécessité des manipulations alimentaires précises. Nous avons développé un régime de drosophile semi-défini, qui est optimal pour la ponte précoce, dans lequel 50% des EAAs diététiques sont fournis en complément d'un milieu à base de levure. La durée de vie peut être prolongée par l'omission du supplément EAA (c.-à-d. DR), mais au prix d'une réduction de la ponte. Ainsi, la dilution spécifique de l'EAA fournit un modèle précis pour comprendre comment la variation alimentaire influence la durée de vie, et le coût de la fécondité associé. Capitaliser sur cet outil et l'orthologie entre la drosophile et les organes des vertébrés, nous avons caractérisé les effets des EAAs sur les transcriptomes dans le cerveau, le corps gras (l'analogue du foie des vertébrés et des adipeux), l'intestin, l'ovaire et le thorax (qui comprend principalement le muscle). Cela nous a permis d'établir systématiquement les effets transcriptionnels de la dilution de l'EAA.
Signatures spécifiques au tissu de DR
Les EAA sont omniprésentes dans les tissus de la drosophile, ce qui nous amène à penser que la RD orchestrerait des changements globaux dans l'expression des gènes à travers les tissus. Nous avons testé de tels changements à l'échelle du transcriptome. Pour chaque gène dans chaque tissu, une mesure du changement de pli moyen dans l'expression sur DR a été calculée, et ces valeurs ont été regroupées. Contrairement aux attentes, cette analyse n'a pas discriminé les clusters clairs . Ce résultat a indiqué que chaque tissu à l'étude présentait une réponse transcriptomique largement indépendante de DR.
Pour tester la spécificité tissulaire de l'effet de DR à une échelle plus granulaire, nous avons analysé l'expression différentielle des gènes indépendamment dans chaque tissu. Des gènes différentiellement exprimés (DE) ont été détectés dans tous les tissus sauf l'ovaire Puisque DR réduit la fécondité et la taille de l'ovaire (observation non publiée), nous supposons que le DR régule le développement des ovarioles, mais sans altérer le transcriptome de chaque ovariole, de sorte qu'aucun changement n'est évident au niveau de l'ovaire entier. L'évaluation du chevauchement des ensembles de gènes DE parmi les tissus a révélé un effet massivement spécifique des tissus de DR. Aucun gène n'était présent dans tous les tissus. Seulement cinq gènes (Cyp9B2, tobi , CG10910, smp-30 ,CG14661 ) ont été exprimés différentiellement dans plus de deux tissus, et les croisements par paires de gènes DE ne comprenaient qu'une faible proportion de changement transcriptionnel global . Ainsi, DR avait des effets hautement spécifiques au tissu au niveau de l'expression génique.
Alors que les transcrits affectés par DR étaient fortement spécifiques des tissus, il restait possible que ces gènes soient impliqués dans les mêmes processus, ce qui pourrait conduire à des effets physiologiques équivalents de la DR parmi les tissus. Pour remédier à cette possibilité, l'enrichissement de la catégorie Gene Ontology (GO) a été analysé pour les gènes DE de chaque tissu. L'analyse GO a révélé que les effets fonctionnels de la DR étaient également spécifiques des tissus (données supplémentaires). Ainsi, DR régule les gènes spécifiques des tissus, associés à des fonctions spécifiques des tissus.
Dans l'ensemble, notre analyse du transcriptome a indiqué que les effets régulateurs de la RD ne peuvent pas être compris au niveau de l'organisme entier: il faut plutôt étudier la régulation des gènes et la fonction des tissus spécifiques.
Le régulateur DR est enrichi dans le régulateur TOR
Bien que les signatures transcriptionnelles de DR étaient fortement spécifiques des tissus, ces changements étaient tous dus au même stimulus en amont (c'est-à-dire, la dilution EAA). Cette communauté a laissé ouverte la possibilité que des voies de signalisation cellulaire similaires médient les effets de DR à travers les tissus. La voie de TOR était une cible forte pour une telle voie, étant donné son rôle conservateur évolutif dans la signalisation de la disponibilité de l'EAA. Dans notre paradigme expérimental, l'ajout de rapamycine au milieu EAA-replet (témoin) favorise des effets phénotypiques similaires à ceux du DR indiquant que la rapamycine agit en aval des EAA pour promouvoir la signalisation de type DR. Par conséquent, nous avons demandé si les effets transcriptionnels de compléter le régime EAA-replet avec de la rapamycine étaient semblables à ceux de DR. Ces échantillons ont été recueillis dans la même expérience, facilitant leur comparaison directe et quantitative.
Pour traiter la congruence des effets transcriptomiques de la DR et de la rapamycine, nous avons isolé les gènes qui étaient en DE après l'alimentation de la rapamycine dans chaque tissu et examiné les chevauchements dans les tissus entre les groupes de gènes régulés par DR et régulés par la rapamycine. Les chevauchements ont été examinés séparément pour les gènes régulés à la hausse et à la baisse, en appliquant des tests hypergéométriques. Cette comparaison n'a pas pu être appliquée dans l'ovaire, puisque DR n'a pas provoqué d'expression différentielle là. L'alimentation par la rapamycine affecte l'expression des gènes dans tous les tissus. En outre, des chevauchements significatifs ont été détectés avec les cibles transcriptionnelles de DR pour tous les tissus, bien qu'aucun gène n'ait été régulé par les deux traitements dans le cerveau, et dans le corps gras, le chevauchement des gènes régulés n'était que marginalement statistiquement significatif. . En tant que deuxième ligne de test à grande échelle, des corrélations intra-tissu dans les changements d'expression génique par rapport au contrôle EAA-replet ont été évaluées, à la fois au niveau du transcriptome entier et seulement des gènes DE. Cette analyse a révélé des effets corrélés de la DR et de la rapamycine sur les gènes DE .Ainsi, l'alimentation en rapamycine non seulement partageait des cibles transcriptionnelles avec DR, mais les changements dans l'expression de ces cibles sont quantitativement semblables. Ce profil était également évident à l'échelle du transcriptome, pour tous les tissus sauf le corps adipeux . Au total, ces trois analyses différentes montrent que, pour au moins une mesure par tissu, les effets transcriptionnels de la dilution alimentaire de l'EAA concordent avec ceux de la signalisation TOR réduite, suggérant que TOR signale en aval de DR pour réguler l'expression génique.
Alors que DR et la rapamycine ont des ensembles de cibles transcriptionnelles qui se chevauchent, ce chevauchement n'est pas complet. Pour se demander si les fonctions associées à TOR réduites étaient compatibles avec celles de DR, nous avons testé les ensembles de gènes régulés par la rapamycine pour l'enrichissement de GO, et comparé à l'analyse équivalente des gènes régulés par DR. Catégories GO similaires ont été enrichies dans les gènes régulés par DR et rapamycine: Par exemple, dans le cerveau, DR et rapamycine gènes régulés impliqués dans le métabolisme des lipides et acclimation froid, alors que dans le corps gras les deux traitements gènes régulés impliqués dans défense antimicrobienne et vitellogenèse. Ainsi, l'alimentation en rapamycine et la RD devraient être associées à des changements physiologiques similaires.
Prédire les facteurs de transcription régulateurs de durée de vie
L'objectif principal de notre étude était de tirer parti des données transcriptionnelles pour prédire les régulateurs des réponses des tissus autonomes à la RD. Les facteurs de transcription (TF) étaient d'un intérêt particulier, en raison de leur capacité à coordonner plusieurs cibles transcriptionnelles pour effectuer un programme physiologique donné. Nous avons recherché les gènes qui étaient DE en réponse à DR pour la sur-représentation des motifs connus pour lier les TFs, en utilisant un outil qui a déjà été utilisé pour prédire avec succès les TF qui régulent le phénotype des mouches. Cette analyse a révélé un fort enrichissement des motifs pour lier les TF GATA dans tous les tissus. L'enrichissement était à la fois omniprésent et hautement statistiquement significatif. Cette association était compatible avec la connaissance antérieure de la biologie évolutive conservée de ces TF: les facteurs GATA jouent un rôle connu dans la signalisation de la disponibilité des acides aminés via TOR chez les eucaryotes évolutifs (par exemple, la levure et les moustiques). De plus, les TF GATA ont des rôles connus dans les réseaux de signalisation régissant la longévité chez C. elegans. Ainsi, l'analyse d'enrichissement de motifs a fourni un résultat logique, associant des transcrits régulés par DR aux TF avec des rôles dans la longévité et la disponibilité de EAA de signalisation en aval de TOR.
Après avoir établi une association entre DR et l'élément de liaison GATA, nous avons demandé si ce signal pouvait être attribué à TOR. Nous avons répété l'analyse des motifs, en nous concentrant sur les cibles transcriptionnelles de la rapamycine. En effet, pour tous les tissus, les gènes qui étaient en DE après l'alimentation en rapamycine étaient également fortement enrichis en l'élément GATA. Ainsi, nos résultats suggèrent un circuit entre les EAAs en circulation, la signalisation cellulaire TOR et l'élément GATA.
Nos résultats ont indiqué des effets transcriptionnels hautement spécifiques des tissus de DR, qui étaient tous associés à la signalisation TOR / GATA. Comment un circuit EAA-TOR-GATA TF omniprésent pourrait-il produire des effets transcriptionnels spécifiques aux tissus? Une possibilité est que l'identité des signaux GATA TF TOR dépend du tissu en question. Le drosophile génome code cinq facteurs GATA, et tracer leur expression dans nos données de transcriptome a révélé que, en effet, chacun a été exprimé avec son propre modèle de spécificité tissulaire . Ces profils d'expression uniques peuvent se combiner avec des facteurs spécifiques au tissu pour traduire la signalisation systémique en un langage d'expression génique local. Au total, nos résultats décrivent un mécanisme candidat dans lequel les facteurs GATA agissent en aval de TOR dans divers tissus pour coordonner la transcription.
Les TF de GATA sont conservées sur le plan évolutif chez les vertébrés, y compris les mammifères, jouant d'importants rôles spécifiques au tissu dans le développement et la maladie. DR et la rapamycine favorisent la durée de vie des rongeurs, ainsi que des mouches, et les effets transcriptionnels des deux interventions ont été établis dans le foie murin par microréseau. Nous avons demandé si des preuves de signalisation GATA pouvaient être récupérées à partir de ces données. Soutenant nos données Drosophila , trois des six TF GATA codés par le génome de la souris ont été différentiellement exprimés, soit en réponse à DR ou un traitement combiné de DR et de rapamycine.Plus précisément, ces données de biopuces a suggéré que, par rapport à une condition d' ad libitum alimentation, GATAd1 , GATA1et GATA6 ont été exprimés de manière différentielle lorsque les souris ont reçu de larapamycine et de la nourriture DR, et que la DR seule était suffisante pour expliquer cet effet pour GATAd1 . Ainsi, l'association entre la DR, la signalisation TOR et les TF GATA semble être conservée chez un vertébré.
Rôles fonctionnels des facteurs GATA dans le phénotype DR
Nos résultats prédits que l'activité spécifique des tissus des facteurs GATA régulé l'effet de DR. Nous avons essayé de tester cette prédiction pour la longévité et la ponte, en nous concentrant sur deux TF de GATA en particulier: srp et Gatae . srp était intéressant car un orthologue de srp chez les moustiques Aedes , AaGATAa , relie les EAA à l'ovogenèse via TOR et à la régulation des précurseurs des protéines du jaune. Cela semble être une fonction évolutionnaire conservée depuis, dans la drosophile, il a connu des rôles dans la régulation oogenesis par les protéines du jaune dans le corps gras, bien que cette fonction n'ait pas encore été connectée aux EAA. Compte tenu de cette information et de l'effet de la RD pour réduire la ponte, la srp semblait être un médiateur probable des réponses à la RD. L'intestin est un autre organe avec un rôle majeur dans l'effet de la durée de vie de DR, donc GATAe a été sélectionné pour le test en raison de son rôle dans le maintien des cellules souches intestinales, et l'association entre leur prolifération tard dans la vie et la longévité. Nous avons testé si GATAe et srp dans le corps de l'intestin et de la graisse, respectivement, ont influencé l'effet de DR sur la durée de vie et la ponte.
Pour manipuler GATAe et srp, nous avons exprimé l'ARNi en utilisant le conducteur TiGS bien caractérisé pour l'intestin, et S 1 106 pour le corps gras, qui sont activés en alimentant un inducteur, RU 486 . Avec ces outils, nous avons demandé si l'expression de l'ARNi contre GATAe dans l'intestin ou contre Srp dans le corps gras a modifié l'effet phénotypique de DR. Pour tester ces réponses, nous avons statistiquement modélisé la survie en utilisant l'analyse des risques proportionnels de Cox (CPH), en utilisant les effets principaux de DR et RU 486 , et un terme d'interaction DR: RU 486 comme variables prédictives. Dans ce paradigme, une interaction significative indique que l'effet de la RD dépend de 486 , fournissant une analyse sensible sans besoin de comparaisons par paires entre les conditions expérimentales.
En l'absence de RU 486 , DR a prolongé la durée de vie de TiGS; UAS-Gatae vole . Cependant, renverser Gatae a considérablement modifié cet effet. GATAe intestinale a accéléré l'apparition de la mortalité indépendante du régime alimentaire, mais, remarquablement, inversé l'effet de DR sur la durée de vie: EAAs prolongé la durée de vie des mouches exprimant GATAe intestinale]. Alors que DR a prolongé la durée de vie médiane de 6% en l'absence de RU 486 , elle a raccourci la durée de vie de 6% en présence de RU 486. L'analyse CPH a détecté un DR significatif: RU 486interaction, confirmant que GATAe intestinale modifié significativement l'effet de la DR sur la durée de vie. Ainsi, l'intervention génétique peut inverser le signe de l'effet de DR sur la durée de vie.
Abattre Srp a également soutenu un rôle pour les TF GATA dans la longévité DR. La DR a prolongé la durée de vie des glossines S 1 106 / UAS-Srp en l'absence de RU 486 .Cependant, l'effet de DR sur la durée de vie dépendait du knock-out Srp révélé par une interaction significative. RU 486 et DR dans l'analyse CPH. Le Srp du corps gras a prolongé la durée de vie médiane de 6% sur les milieux remplis d'EAA, mais de seulement 2% sur les milieux DR. Ainsi, l'expression de cet ARNi semble prolonger la durée de vie seulement lorsque les mouches ont été nourries avec le milieu rempli d'EAA, l’isolant contre l'effet de raccourcissement de la durée de vie de l'alimentation. Ainsi, Srp semble être nécessaire dans le corps gras pour l'effet de raccourcissement de durée de vie des EAAs diététiques. En accord avec l'étude du GATAe intestinal, ce résultat suggère un rôle pour les TF GATA dans la longévité DR.
Une intervention anti-âge idéale devrait être efficace sans coûts biologiques en début de vie. La réduction de la ponte est un coût bien documenté de la DR chez les glossines. Ayant montré que les bénéfices de la DR étaient conditionnés par les TF de GATA, nous avons testé si ces coûts étaient également supportés par ces coûts. Nous avons compté les œufs pondus en début de vie (jour 8 de l'âge adulte) par les mêmes mouches qui ont été testés pour la survie, et analysé la ponte en ajustant les mêmes termes que ceux utilisés pour la survie dans un modèle ANOVA. En accord avec les attentes, en l'absence de RU 486 , DR a réduit la ponte à la fois pour S 1 106 / UAS-Srp et TiGS; UAS-GATAe vole. Cependant, ni Srp ni Gatae a réduit la ponte et n'a pas interagi avec l'effet de la DR sur la ponte. Ainsi, les rôles de ces TF GATA dans le corps de l'intestin et de la graisse sur la longévité DR semblent être indépendants des effets de la DR sur la fécondité.
L'effet de GATAe et de Srp sur la durée de vie, mais pas sur la reproduction, indique que l'influence de DR sur ces traits d'histoire de vie n'est pas obligatoirement couplée à la signalisation. Nous avons émis l'hypothèse que cela pourrait s'expliquer soit par l'effet de DR sur la ponte et la durée de vie étant médiée par le même mécanisme dans des tissus distincts, et, en plus ou en alternance, par des mécanismes distincts dans les mêmes tissus. Srp a fourni un système pour tester ces modèles, puisque nos résultats ont montré que son expression dans le corps gras est nécessaire pour le plein effet de DR sur la longévité, mais pas la fécondité; parce qu'il est exprimé dans les tissus autres que le corps gras ; et parce que c'est un régulateur connu des signaux qui favorisent l'ovogenèse. Par conséquent, nous avons exprimé de manière omniprésente la même construction UAS-Srp que précédemment, sous le contrôle du pilote Daughterless-GeneSwitch (DaGS). Nous nous attendions à ce que cette manipulation systémique interagisse avec DR pour déterminer la durée de vie comme précédemment, mais avec un effet de fécondité supplémentaire. Un tel effet indiquerait un rôle dans la reproduction dans les tissus autres que le corps gras. Conformément aux résultats précédents, l' expression omniprésente Srp a modifié l'effet de DR sur la durée de vie, mis en évidence par un régime alimentaire significatif: terme d'interaction RU 486 dans l'analyse de survie CPH . Ainsi, l'effet de renverser Srp dans le corps gras a eu le même effet qualitatif que knockdown omniprésente. Nous avons ensuite examiné l'effet de l’expression Srp ] omniprésente sur la ponte: Une interaction entre Srp [RNAi] et DR omniprésente suggérerait un rôle direct de Srp dans la médiation des effets de fécondité du régime, tandis que des effets additifs indiqueraient des rôles parallèles. De manière frappante, l’expression Srp omniprésente réduit la fécondité d'un ordre de grandeur. Cet effet a confirmé le rôle de Srp dans la ponte et indiqué un fort coût biologique de cette intervention, contrairement au knockdown restreint au corps gras. Cependant, il n'y avait pas d'interaction entre l'effet de DR et l'effet de Srp . compatible avec Srp et EAAs alimentaires affectant la fécondité via des mécanismes parallèles. Ainsi, l'effet sur la longévité de renverser Srp semble être spatialement discret de son effet de fécondité, si limité au corps gras. Systématiquement, son effet de fécondité semble provenir d'un mécanisme indépendant de l'alimentation. Ainsi, alors que les trois knockdowns GATA de cette étude interagissaient avec l'effet du régime alimentaire pour déterminer la durée de vie, aucun d'entre eux n'interagissait avec le régime alimentaire pour déterminer la fécondité.