Le protocole Western blot est parfaitement aux normes par lesquelles le test immunoblot est mené. Western blot est utilisé pour détecter les protéines dans un échantillon de tissu. Le processus de séparation des protéines natives par détermination des longueurs des polypeptides en utilisant une électrophorèse sur gel. Les protéines elles-mêmes sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose et sondé par des anticorps. La première partie du protocole de transfert de western commence par la collecte de tissus. Ces échantillons sont recueillis soit à partir du tissu vivant ou d'une culture cellulaire. Le tissu est en panne et les inhibiteurs de protéase tels que divers ou la phosphatase sont introduites pour empêcher les enzymes d'accomplir la digestion. Cette partie du protocole est généralement gérée par temps froid pour préserver les tissus. Le processus électrophorèse sur gel est la prochaine étape dans le protocole de transfert de western. Dans cette partie, les protéines sont identifiées par divers facteurs tels que le poids moléculaire ou la charge électrique. Ce procédé est le plus souvent rempli en utilisant des gels de polyacrylamide avec un tampon de dodécyl sulfate de sodium. Fondamentalement, les protéines se charger négativement et de progresser vers une électrode chargée positivement dans le gel. Transfert des protéines est la partie suivante du processus de transfert de type Western globale. Une membrane est placée sur la surface du gel, suivie d'un papier filtre. Comme un courant électrique est administré, les protéines sont retirées dans la membrane. C'est ce qu'on appelle le réel "buvard" partie de l'analyse. Les membranes sont très fragiles et facilement susceptibles d'être endommagés. L'écoulement correct du protocole western blot appelle à l'étape connue comme ayant force obligatoire. Afin d'éviter la contamination des protéines elles-mêmes par les anticorps qui doivent être ajoutés, une sorte de besoins de protection à mettre en œuvre. Le type le plus commun de blocage utilise du lait écrémé sec et un détergent. Cette lie aux taches et s'ouvrent dans la membrane et permet de clarifier les résultats lorsque l'anticorps est ajouté. La détection est la prochaine étape pour corriger selon le protocole. Les protéines sont introduites à des anticorps qui ont été liés à une enzyme spécifique qui donnera aux chercheurs les informations souhaitées. L'anticorps est incubé avec la membrane pendant 30 minutes ou plus. Par la suite, la membrane est lavée et un anticorps secondaire est introduit qui se lie à la première. Souvent, un agent luminescent est utilisé pour aider les scientifiques du processus d'identification. Le matériau est lavé à nouveau pour supprimer tous les éléments non fixés. Analyse de la taille des bandes colorées révèle des informations concernant l'importance et de l'étendue d'une protéine spécifique. Ceci est généralement achevé à quelques reprises pour s'assurer de la bonne analyse. Options pour la détection inclure des radiographies, des colorants et des produits chimiques.