Séparation d'exosome par ultracentrifugation
Quelle est l'importance de l'isolement exosome dans votre recherche?
Dans la clinique ambulatoire et dans le laboratoire, nos études de recherche actuelles visent à comprendre les mécanismes de libération et de dépollution et les fonctions biologiques des exosomes et des particules de membrane dans le plasma des individus qui développent l'emphysème, une forme de maladie pulmonaire obstructive chronique caractérisée par l'élargissement de Espaces aériens et perte d'alvéoles.
Les composants solubles dans la fumée de cigarette (CS) initialement inhalés et ensuite absorbés dans la circulation sont la lésion la plus fréquente qui conduit à l'emphysème et à la MPOC. Nous avons montré que l'exposition aiguë à la CS est suffisante pour stimuler la libération d'exosomes et de particules membranaires à partir de cellules endothéliales pulmonaires avec un potentiel hautement pro-inflammatoire basé sur leur analyse de la cargaison: molécules pro-coagulantes et pro-inflammatoires de surface, lipides bioactifs et MiARN.
Les exosomes et les particules de membrane sont extrêmement petits, de taille nanométrique, les particules circulantes libérées dans le flux sanguin par des cellules structurelles, endothéliales ou circulantes, comme les leucocytes ou les plaquettes. Nous avons isolé des exosomes et des particules de membrane en utilisant une ultracentrifugation différentielle. Cette méthode nous a permis de granuler les exosomes et les particules de membrane en fonction de leur densité, pour obtenir une séparation complète de la phase fluide et pour remettre en suspension le granulat dans divers tampons requis pour le comptage en aval (comptage de cytométrie en flux), qualitatif (protéines membranaires, lipides, MiARN) et des études fonctionnelles (absorption par les macrophages).
Comme tous les fumeurs ne développent pas d'emphysème, nous croyons que l'abondance d'exosomes dans le sang des fumeurs actifs nous permettra d'identifier les individus à risque de déclin de la fonction pulmonaire, d'exacerbations infectieuses fréquentes et de comorbidités systémiques fréquentes associées à la cigarette et à la MPOC (par ex. Artérielle et veineuse Les événements thrombotiques, la cachexie ou le cancer du poumon).
Outre leur rôle dans le diagnostic des fumeurs à risque, les exosomes peuvent représenter la signalisation paracrine et épigénétique associée à la cargaison qu'ils peuvent transporter, par exemple les lipides bioactifs (p. Ex. Les céramides), les récepteurs membranaires de surface et les molécules de signalisation (par exemple, la phosphatidylsérine) ou les miARN ( Par exemple -125a, -126 et -191).
Traditionnellement, quelles méthodes ont été utilisées pour l'isolement des exosomes et d'autres vésicules extracellulaires (EV)?
Au cours des quinze dernières années, les méthodes d'enrichissement pour une population pure de vésicules extracellulaires ont fait l'objet d'un examen minutieux dans le but d'uniformiser la nomenclature, les méthodes d'isolement et d'analyse.
À la suite de la déclaration de position de la Société Internationale pour les Vésicules Extracellulaires, nous utilisons la nomenclature suivante des populations d'EV isolées dans notre laboratoire à partir d'échantillons humains (par exemple sang, fluide BAL) ou surnageants de cellules cellulaires (cellules épithéliales humaines et endothéliales primaires, macrophages humains). Les exosomes ont été définis comme des particules allant de 30-150nm, le reste des EV était des particules de membrane (200nm - 1μm) et des corps apoptotiques (3-5 μm).
Plusieurs méthodes, y compris la filtration et l'isolation de l'immuno-affinité, ont été utilisées depuis les années 1970. La méthode d'ultracentrifugation pour la séparation des particules de petite taille a été introduite au milieu du 20ème siècle lorsqu'il a été utilisé pour isoler les virus enveloppés.
Les EVs plus importants (microparticules et corps apoptotiques) sont granulés à des forces de centrifugation à faible vitesse dans la gamme de 10 000 à 20 000 X g. Les EV plus petits, y compris les exosomes nécessitent des forces à grande vitesse (100 000 à 200 000 X g).
En raison des préoccupations de l'agrégation des EV et de la «contamination» des protéines ou des lipides lors de l'ultracentrifugation à grande vitesse, plusieurs protocoles recommandent des étapes de lavage et des gradients de densité de saccharose PBS pour une séparation efficace des exosomes des agrégats protéiques ou lipidiques.
Une nouvelle méthode d'isolement, la précipitation polymère utilisant ExoQuick de System Bioscience est moins laborieuse que les méthodes précédentes, mais il existe des préoccupations quant à la pureté des EV dans le précipité et à l'utilisation limitée dans d'autres méthodes d'analyse (p. Ex. Microscopie électronique, cytométrie de flux, western tache).
Notre laboratoire a utilisé l'ultracentrifugation différentielle suivie des techniques de cytométrie en flux et de suivi optique de particules (Nanosight NS300) pour l'isolement et la quantification d'EV à partir de surnageants de culture de cellules endotheliales. Nanosight utilise la diffusion de la lumière et le mouvement brownien afin d'obtenir la distribution de la taille et la mesure de la concentration des EV dans la suspension liquide. Les deux techniques ont produit des résultats similaires, ce qui nous permet d'isoler et de compter une population HSE hétérogène, enrichie d'exosomes, qui contient également des particules de membrane, mais pas de corps apoptotiques.
Quel impact a eu l'ultracentrifugation sur l'isolement EV?
Dans notre laboratoire, une ultracentrifugation différentielle à deux vitesses, suivie d'une vitesse élevée, donne une population EV enrichie en exosomes (> 90%) et en particules de membrane (<10%). Nous préférons cette méthode d'isolement car, après une étape de lavage PBS supplémentaire, nous permet de séparer efficacement les EV plus importants des exosomes et des particules de membrane tout en préservant l'expression de la molécule de membrane de surface et la cargaison de la première.
L'ultracentrifugation différentielle suivie de la cytométrie de flux nous a permis d'identifier un nouveau mécanisme distinct de libération pour les EV de taille réduite en réponse à une exposition aiguë des cellules endothéliales aux composants CS solubles. Les exosomes et les particules de membrane libérée par CS nécessitaient une activation de l'isophingomyélinase de l'acide de la synthèse de céramide (aSMase), une enzyme critique pour l'activation induite par le stress, l'autophagie et l'apoptose dans les cellules structurelles pulmonaires (p. Ex. Cellules endothéliales et épithéliales).
Au cours de l'activation aSMase suite à une exposition aiguë au CS, nous avons identifié très peu d'EV positifs pour le marqueur de l'apoptose, l'annexine V dans les échantillons de sang humain et dans les cellules endotheliales cultivées in vitro. Ces résultats indiquent que l'achèvement de l'apoptose peut ne pas être nécessaire pour la libération d'EV EV induite par CS. En effet, notre étude de microscopie à lapse temporelle a montré la libération d'EV pendant la contraction cellulaire, simultanée à la déstabilisation de la membrane, à la formation de filopodes et à la formation de filopodes.
L'ultracentrifugation différentielle nous a également permis d'étudier une nouvelle fonction biologique des exosomes libérés par CS et des particules membranaires dérivées des cellules endothéliales, celle de l'inhibition de la clairance apoptotique cible (efferocytose) par les macrophages spécialisés. Cela a été possible car les étapes d'ultracentrifugation ont conservé l'intégrité, la stérilité et l'activité biologique des EV isolés.
L'inhibition de l'efferocytose dépend du nombre d'EV et de la cellule d'origine (cellules endothéliales), car une EV moins élevée ou des EV à base de monocytes n'ont eu aucun effet sur l'efferocytose. Ces résultats suggèrent un effet concurrentiel des EVs délivrés par le CS et dérivés de l'endothélium avec des cibles apoptotiques pour l'absorption et la clairance des phagocytes.
Pouvez-vous décrire les principaux avantages de l'utilisation de l'ultracentrifugation par rapport aux autres méthodes d'isolement EV?
À ce jour, la plupart des études publiées sur EVs provenant de biofluides humains ou de surnageants de cultures cellulaires ont utilisé une centrifugation suivie ou non d'une ultracentrifugation pour l'isolement de l'EV. Les principaux avantages sont la séparation et la préservation des populations isolées d'EV pour d'autres études quantitatives et qualitatives. L'ultracentrifugation est la seule méthode qui permettra l'utilisation subséquente de la granulométrie EV dans les études de cytométrie en flux, de protéomique, de lipidomique, d'ARN et d'absorption / dépollution.
Les autres méthodes, la filtration, l'isolement par l'immuno-affinité ou les précipitations polymères ne permettront pas la séparation du biofluide (filtration), masqueront les molécules de surface (les anticorps contre les marqueurs de surface sont utilisés pendant l'isolement par l'immuno-affinité) et introduira une contamination plus élevée des protéines ou des lipides "(Cas de précipitation polymère).
Si normalisé, l'ultracentrifugation suivie d'une cytométrie en flux peut permettre facilement le nombre d'EV dans le sang et d'autres biofluides (salive, lavage nasal, liquide péritonéal, urine) pour être traduit en pratique clinique en tant que biomarqueur de la présence et de la gravité de diverses maladies.
Nous et autres enquêteurs avons signalé des EV révélés par les cellules endothéliales pour être présents en plus grand nombre de fumeurs atteints de MPOC / emphysème précoce par rapport aux fumeurs atteints d'une maladie avancée. D'autres études prospectives sont nécessaires pour expliquer cette découverte et ses implications cliniques. Une explication possible est que, dans les maladies avancées, il y a une perte de lits capillaires pulmonaires avec une perte de surface superficielle des cellules endothéliales et que les fumeurs ayant un nombre élevé d'EV au plasma courent le risque d'une diminution plus rapide de la fonction pulmonaire et d'un emphysème / développement de la MPOC.
Quel instrument utilisez-vous pour effectuer l'ultracentrifugation dans votre recherche?
Notre laboratoire a utilisé avec succès l'ultracentrifugeuse Optima XE-90 de Beckman Coulter. Il s'adapte à la fois à un angle fixe et à un rotor oscillant nécessaire pour des gradients différentiels et des gradients de densité de saccharose différentiels.
Pourquoi avez-vous choisi cette ultracentrifugeuse particulière?
Lorsque nous avons décidé d'acheter une ultracentrifugeuse, un produit Beckman Coulter était notre premier choix basé sur la réputation, la fiabilité et l'excellent service à la clientèle. Nous avons choisi la série Optima X en raison de sa polyvalence avec différents rotors, caractéristiques de biosécurité et interface utilisateur facile à naviguer.
De quelle manière envisagez-vous d'utiliser l'ultracentrifugation dans votre recherche à l'avenir?
Nous continuerons à utiliser les EV de plasma et l'abondance d'exosome comme l'un des principaux paramètres dans tous nos modèles murins d'emphysème qui étudient la santé et le dysfonctionnement de l'endothélium.
Dans nos projets récents, nous étudions les mécanismes de prise en charge de l'EV par les cellules voisines (endocytose médiée par clathrin versus caveoli) et les voies intracellulaires activées dans les cellules receveuses après l'internalisation de l'EV.
Nous nous concentrons sur l'internalisation de l'EV endothélial dérivé par d'autres cellules endothéliales ou par des macrophages. Nous prévoyons utiliser l'ultracentrifugation pour l'isolement de l'EV à partir des surnageants de cellules endothéliales et pour le fractionnement des membranes des cellules réceptrices en utilisant un gradient de saccharose.
Nous souhaitons étudier plus avant le rôle des lipides bioactifs sécrétés sous forme de molécules individuelles ou transportés dans les EV. Il existe des lipides bioactifs impliqués dans la réparation cellulaire (p. Ex. Le phosphate de sphingosine-1) ou les lésions cellulaires (par exemple, les céramides, la sphingosine) dans le donneur, l'EV et les cellules endothéliales réceptrices.
La libération d'EVs riches en céramide par les cellules endothéliales lors de l'exposition au CS est liée à une activation de la MS-Mase qui peut entraîner d'abord un bourdonnement de la membrane, un mécanisme qui aide à éliminer les taches de membranes plasmiques endommagées afin d'atténuer les lésions des cellules endothéliales. Plus tard, l'activation de l'aSMase entraînera une apoptose des cellules endothéliales et une libération d'EV apoptotique.
Nous supposons que dans l'emphysème / COPD, cette dernière est due à un déséquilibre entre la signalisation du phosphate de la céramide et de la sphingosine-1 et ce message est transmis pour la signalisation cellulaire par cellule par VE.
Nous prévoyons utiliser l'ultracentrifugation différentielle des surnageants de cellules endothéliales pour isoler les EV EV aptotiques (corps apoptotiques) à partir de l'exosome, des particules de membrane et des agrégats lipidiques. Cela nous permettra d'analyser chaque fraction par chromatographie en phase liquide combinée et de spectrométrie de masse en tandem pour les lipides bioactifs et déterminer si les lipides liés à l'EV exercent des fonctions biologiques différentes des lipides sécrétés dans les agrégats lipidiques.
Que pensez-vous que l'avenir existe pour l'isolement EV et quels progrès de l'ultracentrifugation espérons-vous voir?
Le domaine des EV est dans sa jeunesse. Alors que les EV et la libération d'exosome peuvent être pertinentes pour la pathogenèse et la progression de toute maladie inflammatoire, immunitaire ou auto-immunisée, nous devons faire des progrès significatifs avant de déplacer la recherche EV du banc au patient.
Nous devons valider une méthode d'isolement. La majorité de la littérature publiée dans le domaine de l'EV a utilisé l'ultracentrifugation à divers degrés et même compte tenu des inconvénients mineurs («populations impures» EV, protéines ou lipides-agrégats «contamination»), l'ultracentrifugation est la plus reproductible, accessible et facile à Technique de commercialisation.
Nous devons également valider une méthode de quantification. Si cela va être une cytométrie de flux ou d'autres techniques de microscopie (microscopie électronique, microscopie électronique de transmission, microscopie à force atomique ou analyse optique de suivi de particule unique) doit encore être déterminée. Sans ces deux jalons essentiels, le champ EVs ne tient pas compte de la protéomique, de la lipidomie ou de l'analyse fonctionnelle des EV et des exosomes en profondeur.
Une étape importante vers la réalisation de ces jalons serait le développement d'un «tube intégré d'ultracentrifugation à gradient de saccharose» qui permettrait une meilleure séparation des EV par taille et éliminerait la «contamination» des protéines ou des lipides. Je suis convaincu que nous serons témoins de découvertes décisives dans l'isolement et la quantification de l'EV dans la décennie à venir.