Détection d'une seule molécule de protéines dans des cellules individuelles
Pouvez-vous donner une introduction à la matrice de molécules unique (Simoa) que vous avez développé et que vous discuterez lors de votre entretien à Pittcon 2017?
Nous avons développé cette technologie il y a près de 10 ans. Il a été développé après une expérience clé menée par David Rissin, qui était un candidat au doctorat dans mon laboratoire à l'époque.
À l'époque, nous travaillions avec des tableaux de micropuits pour un projet différent. Lors d'une réunion de laboratoire, j'ai posé la question suivante: «Combien de molécules d'une molécule fluorescente prend-il pour ramener la concentration dans l'un de ces minuscules micropuits à un niveau qui serait facilement détectable?» Nous avons effectué le calcul et il s'est avéré Soit environ 100 molécules d'un colorant fluorescent.
David a effectué une expérience en utilisant un réseau de micropuits à fibres optiques, qui disposait d'environ 60 000 micropuits à la fin d'une fibre optique. Nous avons piégé une solution très diluée d'une enzyme dans ces micropuits - chaque micropuits avait un volume de l'ordre de 40 femtoliters (10 à 15 litres) - un très petit volume.
L'expérience a été conçue pour piéger une solution très diluée d'une enzyme contenant une forte concentration d'un substrat. Les substrats sont les matériaux de départ pour les enzymes, de sorte que s'il y avait une enzyme présente, l'enzyme catalyserait la conversion de ce substrat en plusieurs molécules d'un produit fluorescent. Ce processus se produirait très rapidement avec la β-galactosidase, qui est une enzyme assez active.
L'idée était que nous allions exécuter cette réaction à une telle concentration diluée d'enzyme que seule une fraction des puits contiendrait une molécule enzymatique et seuls les puits qui faisaient de la fluorescence. Après que David Rissin a élaboré les détails techniques nécessaires pour mener à bien l'expérience, il a démontré que l'on pouvait clairement voir quels puits contenait une molécule d'enzyme car ils devenaient de couleur rouge très brillant, contrairement aux puits qui ne contenir aucune molécule d'enzyme qui est restée noire.
Après cette démonstration, nous avons observé que lorsque nous avons diminué la concentration de l'enzyme, nous avons observé moins de puits fluorescents parce qu'il y avait moins de molécules enzymatiques dans le réseau. Nous avons publié un article dans Nano Letters et avons affirmé que c'était la première fois que quelqu'un avait mesuré la concentration en comptant des molécules.
Donc, cette expérience a été la première démonstration que vous pourriez prendre une solution, la confiner en très petits volumes et littéralement compter le nombre de molécules présentes dans cette solution. Dans ce cas, la concentration en ß-galactosidase pourrait être mesurée en comptant simplement le nombre de puits lumineux par rapport au nombre de puits sombres.
Simoa a été développée parce que nous nous sommes demandés si nous pouvions utiliser cette approche pour mesurer réellement les choses dont les gens s'intéressaient. Par exemple, les biologistes s'intéressent particulièrement à la mesure des molécules telles que les acides nucléiques et les protéines.
Au fil du temps, la technologie de matrice moléculaire unique développée, où les réactifs de liaison sont maintenant attachés à des microsphères ou des «perles» afin de capturer les molécules cibles d'intérêt de la solution. Les billes contenant les molécules cibles liées sont ensuite marquées avec une molécule d'enzyme et chargées dans les puits et les puits sont scellés.
S'il existe une molécule d'enzyme attachée à un cordon, elle agit comme un journaliste pour la molécule d'acide nucléique ou la molécule de protéine d'intérêt. La molécule d'enzyme ci-jointe catalyse la conversion de nombreuses molécules de substrat en produit de sorte que les puits contenant de l'enzyme forment une concentration de produit et une fluorescence localement élevée. Les puits contenant des perles mais sans molécules liées resteront sombres. C'est toute l'évolution de la technologie.
Quelle est la sensibilité de Simoa à la détection de protéines et d'acides nucléiques?
En ce qui concerne les acides nucléiques, il est proche d'autres techniques sensibles telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Par exemple, il y a eu des démonstrations dans lesquelles une séquence d'acide nucléique particulière peut être détectée à la concentration femtomolaire (10 -15) de sorte que la sensibilité peut même être supérieure à celle.
Il en va de même pour les protéines où la limite de détection de Simoa est typiquement d'environ 100 à 1000 fois plus sensible que la méthode traditionnelle d'effectuer un dosage de protéines - la technique de dosage immunosorbant enzymatique (ELISA). La technologie Simoa ouvre le potentiel de mesure des protéines à des concentrations qui n'ont jamais été détectées avant dans différents types d'échantillons, y compris le sang, qui est l'objectif principal des analyses basées sur Simoa.
Pouvez-vous expliquer comment vous avez appliqué la méthode à l'analyse des cellules cancéreuses cultivées?
Nous avons simplement changé la manipulation et la préparation de l'échantillon afin qu'il puisse être appliqué à un test de cellule unique. Il s'agit encore d'un test Simoa classique qui utilise des anticorps de capture attachés aux perles afin de lier les protéines d'intérêt pour les cellules individuelles.
Pour la préparation des échantillons, nous isolons d'abord les cellules individuelles, manuellement ou avec une variété de procédures d'isolement cellulaire unique, telles que la cytométrie en flux ou la microfluidique. La clé est d'isoler les cellules individuelles en très petits volumes.
Nous prenons ensuite les cellules isolées et les lys pour perturber leurs membranes et libérer leur contenu dans un petit volume de tampon. Nous ajoutons ensuite des perles et capturez les molécules que nous souhaitons détecter. Tout suit le flux de travail conventionnel pour Simoa.
L'objectif est de pouvoir étudier les cellules individuelles au sein d'une population. Il est maintenant reconnu que l'homogénéisation d'une population de cellules, généralement des milliers, sinon des millions de cellules, lorsqu'on effectue une mesure donne une concentration moyenne de la protéine ou de l'acide nucléique qui se trouve dans les cellules. De telles mesures masquent l'hétérogénéité de la population cellulaire.
En utilisant Simoa, nous pouvons mesurer les concentrations de protéines dans les cellules cancéreuses individuelles. L'observation de centaines de cellules à la fois au niveau de la cellule unique donne un aperçu de l'hétérogénéité de la population cellulaire. En développant une technologie capable de mesurer les concentrations de protéines dans les cellules individuelles, nous sommes en mesure d'examiner la répartition des concentrations de protéines au sein de la population.
Une utilisation possible d'une telle technologie serait dans un contexte clinique pour étudier les biopsies tissulaires. Par exemple, si l'on prenait une biopsie à l'aiguille d'une femme qui avait une mammographie anormale, les cellules individuelles pourraient ensuite être dissociées de ce tissu de biopsie et analysées, par opposition à regarder la moyenne de la population.
Cette approche est importante parce que s'il y avait des cellules rares dans l'échantillon qui ont eu un phénotype particulièrement agressif, même une sur 1000 ou une cellule sur 10 000 dans cet échantillon de tissu, il serait difficile de détecter cette cellule si vous étiez Pour homogénéiser le tissu d'abord et ne regardaient que la moyenne de la population cellulaire. Cette cellule agressive particulièrement rare se divise rapidement et pourrait finir par conduire à une maladie métastatique et finalement un mauvais résultat pour le patient.
Lorsque les pathologistes évaluent les échantillons de biopsie, ils examinent la population cellulaire globale et ils n'obtiennent pas le niveau de granularité nécessaire pour déterminer s'il existe un présent de cellules rares particulièrement agressif qui donnera au patient un mauvais pronostic. En regardant la moyenne, vous pourriez conclure: «Bien, 9 999 cellules sont normales», car cette rare 10 000e cellule est en moyenne dans les résultats et les résultats sont donc biaisés en faveur de la moyenne de la population.
Quelles sont les autres applications de Simoa?
Il existe une grande variété d'indications cliniques faisant l'objet d'une enquête. Cette technologie a été commercialisée par Quanterix, une société basée au Massachusetts dont je suis le fondateur scientifique. Ils ont autorisé les brevets issus de mon laboratoire Tufts et commercialisent la technologie.
Mon laboratoire a porté principalement sur le cancer du sein et la détection des maladies infectieuses. Nous commençons maintenant à regarder la maladie de Parkinson en utilisant la technologie. D'autres chercheurs étudient diverses maladies inflammatoires. Il existe également une communauté assez importante qui utilise la technologie pour examiner les troubles neurologiques; En particulier, des traumatismes traumatiques.
La Ligue nationale de football aux États-Unis a financé une partie de la recherche qui examine les marqueurs sortis du cerveau lorsque le cerveau subit une blessure traumatique. Ces protéines sont libérées et apparaissent dans le flux sanguin, et semblent être hautement prédictives de l'ampleur du traumatisme cérébral.
D'autres chercheurs ont utilisé la technologie Simoa pour commencer à regarder les marqueurs de sang pour la maladie d'Alzheimer. D'autres encore utilisent Simoa pour détecter les signes précoces de crise cardiaque, en mesurant certaines protéines qui sont relâchées dans les premiers stades lorsque le cœur commence à avoir des problèmes.
Qu'est-ce que les membres de l'auditoire apprendront lors de votre entretien à Pittcon 2017?
Chez Pittcon, je parlerai de certains détails techniques de la préparation des échantillons pour obtenir des cellules isolées isolées afin de réaliser des mesures biologiques significatives.
Je vais également présenter quelques-uns de nos derniers travaux avec diverses cellules de cancer cultivées où nous avons pu multiplexer les analyses et je montrerai des mesures significatives qui indiquent que nous avons de bonnes chances de détecter des cellules rares lorsque nous appliquons cette technologie à Échantillons cliniques.
Quel impact pensez-vous que Simoa aura à l'avenir en ce qui concerne la détection de cellules rares?
J'ai déjà mentionné la détection de cellules rares agressives dans les biopsies tissulaires dans un contexte clinique, mais il existe également un élément de recherche en plus de la composante clinique.
Dans un contexte de recherche, l'une des questions intéressantes de notre point de vue est ce que ressemblent ces cellules rares? Comment diffèrent-ils de la moyenne de la population? Il y a eu beaucoup d'effort dans la génomique cellulaire unique en raison de la grande variété des technologies génétiques, y compris le séquençage, qui sont maintenant disponibles. À la suite de ces technologies, il existe la possibilité d'isoler les cellules individuelles, de les étiqueter et de voir comment la génétique diffère d'une cellule à l'autre.
Bien sûr, cela nous donne un aperçu intéressant de la variabilité cellulaire, mais l'une des choses auxquelles les gens sont extrêmement intéressés est de savoir comment ces changements génétiques se manifestent en fonction de la façon dont la cellule exprime différentes protéines et comment la cellule diffère réellement À partir de ses cellules environnantes?
Encore une fois, passer du génotype au phénotype est une zone beaucoup moins explorée, et c'est ce à quoi mon laboratoire est concentré, en essayant de comprendre à quel point ces différences sont grandes. Si nous pouvons maintenant combiner les deux technologies et corréler le génotype - les différences génétiques - avec le phénotype - la façon dont les protéines sont exprimées et l'apparence physique de la cellule, alors nous aurons une meilleure compréhension de la façon dont les cellules rares ont la Capacité de faire des choses que la plupart des autres cellules de la population ne peuvent pas faire.
Alors, bien sûr, la prochaine étape consiste à trouver une façon d'étendre cette technologie de telle sorte qu'elle puisse devenir une technique de diagnostic, de sorte qu'elle puisse être utilisée dans la clinique ainsi qu'un outil de recherche.
Que pensez-vous que l'avenir existe pour la détection d'une seule molécule et l'analyse d'une seule cellule?
Je pense que ces deux domaines sont incroyablement prometteurs. Ce qui unit la détection d'une seule molécule et l'analyse d'une seule cellule est que la molécule est l'unité fondamentale de la chimie et la cellule est l'unité fondamentale de la biologie.
Nous sommes dans les premiers temps de pouvoir analyser des molécules uniques, regarder les populations de molécules et, avec certaines des technologies plus biophysiques, regarder des molécules uniques et les observer au fil du temps. Mon laboratoire a démontré cette capacité avec des molécules uniques relativement grandes telles que les enzymes.
Les cellules simples sont les unités fondamentales de la biologie. Tout comme les cellules simples ont des différences lorsque vous commencez à regarder les niveaux de protéines en elles ou la séquence d'ADN dans des cellules ostensiblement identiques, lorsque vous regardez des molécules uniques, vous voyez également une répartition des comportements.
Nous sommes maintenant au stade où nous avons les technologies et la résolution pour commencer à observer ces différences individuelles entre les comportements des molécules individuelles et des cellules individuelles. Je pense que cela va certainement réécrire certains des manuels scolaires dans des domaines tels que la biochimie et la biologie parce qu'il n'existe pas de moléculaire moyenne ou de cellule moyenne. Chaque cellule a sa propre identité. Chaque molécule a sa propre identité.
Ces comportements ont déjà été traités comme des propriétés moyennes des molécules et des cellules. Le comportement stochastique des molécules individuelles peut avoir des implications importantes qui affectent les processus biochimiques, les voies et finalement les propriétés des cellules individuelles. Et vous pouvez commencer à regarder ces voies et processus et à surmonter comment les propriétés des molécules individuelles se manifestent au niveau de la cellule unique.
Quels progrès de la technologie voudriez-vous voir et pourquoi?
Une chose que je voudrais continuer dans mon laboratoire est de pousser la limite de la sensibilité pour détecter des concentrations encore plus faibles que celles que nous avons pu atteindre jusqu'à présent. Ce que nous avons réussi à accomplir jusqu'à présent est de mesurer les protéines à une concentration inférieure de deux à trois ordres de grandeur. Il serait formidable de rechercher une sensibilité supplémentaire de dix à cent fois plus.
Il y a beaucoup plus de choses que nous pourrons examiner avec un niveau de sensibilité plus élevé. Même aujourd'hui, lorsque nous mesurons des échantillons de sang, nous ne voyons pas certaines protéines parce que la technologie Simoa, même avec une sensibilité mille fois plus élevée, ne nous donne pas la sensibilité dont nous avons besoin pour mesurer certaines des molécules présentes Sang à des niveaux d'expression inférieurs. J'aimerais voir le mouvement continu de cette limite inférieure de détection à des niveaux encore plus sensibles.
Je pense également qu'il serait formidable d'augmenter le niveau de multiplexage de sorte que plus de molécules de différents types puissent être mesurées simultanément.
Ensuite, enfin, et c'est quelque chose dont je n'ai pas de solution technologique, mais certainement quelque chose que j'aimerais voir, j'aimerais pouvoir commencer à appliquer ce type de technologie de comptage moléculaire aux petites molécules. Nous utilisons des essais immunologiques et des analyses d'acides nucléiques qui captent de grandes molécules, mais la technologie que nous avons développée n'est pas susceptible de pouvoir mesurer de petites molécules comme les métabolites. Évidemment, il serait formidable de pouvoir le faire.